大家好呀！ 今天带来一个实验干货 小鼠骨髓造血干细胞的流式检测全流程 造血干细胞可以说是血液系统的“种子细胞” 研究它们对理解血液疾病超重要！ 什么是造血干细胞？ 它是一类存在于骨髓、外周血和脐带血中的成体干细胞 具有自我更新和多向分化能力 能够生成所有类型的血细胞和免疫细胞 主要来源有三个 骨髓 存在于人体的骨髓腔中，如髂骨、胸骨、脊柱等部位的骨髓 骨髓中的造血干细胞能够不断地分化和增殖，生成各种血细胞。 外周血 在正常情况下，外周血中的造血干细胞含量极少 但通过使用某些药物（如粒细胞集落刺激因子） 可以动员骨髓中的造血干细胞释放到外周血中 使其在外周血中的含量增加 从而可以从外周血中采集造血干细胞用于移植 脐带血 脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后 残留在胎盘和脐带中的血液 其中含有丰富的造血干细胞 脐带血来源的造血干细胞 具有免疫原性低、供体来源广泛、配型要求相对较低等优点 是造血干细胞的重要来源之一 实验方案来了 本次实验采用的样本类型是小鼠骨髓细胞 样本制备环节 一，将小鼠腿部完整取出 分离肌肉，取出股骨与胫骨 浸泡在预冷的PBS + 2% FBS中，置于冰上 注意避免对骨髓组织造成过度损伤 不然会影响细胞活性和结果 二，沿骨骺剪开骨头两端松质骨部分 用1 ml注射器吸取预冷的PBS + 2% FBS 从一端开口将骨髓从另一端开口吹出 并将两端松质骨部分剪开 将所有骨髓组织吹至预冷的PBS + 2% FBS中 三，将含有骨髓组织的 PBS + 2% FBS转移至15 ml离心管中 并用注射器反复吹吸打散细胞 至无明显骨髓组织团块 四，4℃下300×g离心5分钟后 红细胞用1ml低渗ACK（氯化铵钾）溶液 在冰上溶解1-5分钟 剩余细胞悬浮于20ml染色缓冲液中离心 五，在离心细胞后，丢弃上清 将细胞重悬于5ml染色缓冲液中计数 胫骨和股骨的正常细胞数为5-8x10的7次方 抗体组合如图 染色步骤 HSC染色 取1 x 10的6次方细胞 用预冷的PBS + 2% FBS调整至100 μl体积 加入各荧光素标记的抗体 置于摇床、避光孵育15分钟 建议在4℃下进行孵育，以减少非特异性结合 孵育结束后，400g离心5min弃上清 每孔用200μl -1ml 0.5%BSA/PBS重悬洗涤 400g离心5min弃上清 确保洗涤过程轻柔，避免细胞丢失 重悬细胞，上机分析 实验结果如下图 圈门策略 FSC-A/SSC-A散点图圈出目的细胞群 FSC-A/FSC-H、SSC-W/SSC-H排除粘连体 DAPI排除死细胞 圈出Lin-- (CD3- Gr-1- CD11b-B220-)细胞群 定义不同的细胞亚群： LSK：Lin- Sca-1+ c-Kit+ LS-K：Lin- Sca-1- c-Kit+ LSlo Klo：Lin− Sca-1lo c-Kitlo 髓系祖细胞的分群： CMP : LS− K CD34+ FcγR− GMP: LS- K CD34+ FcγR+ MEP: LS− K CD34− FcγR− HSC: LSK CD150+ CD48− 根据造血干细胞的自我更新和分化潜能等特性 将其进一步分为： LT-HSC: LSK CD34− Flk2− ST-HSC: LSK CD34+ Flk2− MPP: LSK CD34+ Flk2+ CLP: Lin− Sca-1lo c-Kit loFlk2+ IL7Rα+。 以上就是这次流式实验的完整流程啦！ 如果大家有具体问题，欢迎留言讨论哦~ 记得收藏，实验顺利不迷路！